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崔元曦，田  宇，佟晓凤，苏  醒，华思锐，白素英*

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

论文摘要

B淋巴细胞瘤2基因相关启动子(Bcl-XL/Bcl-2 associated death promoter，Bad)是麝鼠(Ondatra zibethicus)香腺miRNA测序筛选出的显著差异miRNA靶基因之一。为了解麝鼠Bad基因的基因结构和生物学功能，探讨其在麝鼠香腺发育和泌香中的作用，通过比对麝鼠的全基因组获得麝鼠Bad基因的CDS区序列，并利用多种在线预测软件进行生物信息学分析。结果表明：麝鼠Bad基因的CDS区全长为615 bp，编码204个氨基酸，编码的蛋白相对分子质量为22 087.40、等电点为9.63、不稳定系数为72.03、平均亲水系数为-0.885，是不稳定的亲水蛋白，无跨膜结构，无信号肽，有26个潜在的磷酸化结合位点。亚细胞定位结果显示，该蛋白主要定位于线粒体。二级结构主要由α-螺旋(32.84%)、无规则卷曲(56.86%)、β-转角(4.90%)和延伸链(5.39%)构成。构建系统发育进化树结果显示，麝鼠与仓鼠科(Cricetidae)亲缘关系最近，说明Bad基因在进化过程中相对保守。蛋白质互作预测结果显示，Bad蛋白与Bcl-2、Akt、Ywhaq、Ywhaz、Ywhab等蛋白相互作用，提示Bad蛋白与这些蛋白间的相互作用可能促进麝鼠香腺萎缩；与Mapk8等互作提示在香腺发育时具有抑制凋亡的作用。研究结果为进一步探究麝鼠Bad基因在香腺周期性发育中的功能提供参考。

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论文速览

麝鼠(Ondatra zibethicus)原产自北美，是一种珍贵的毛皮动物，具有较高的经济价值，易于人工饲养。麝鼠食性较为广泛，主要以新鲜的果实、蔬菜的块茎为主，同时也食小鱼、小虾等水生小动物。麝鼠又被称为麝香鼠，是仓鼠科（Cricetidae）中唯一会泌香的动物。麝鼠中只有雄性的成年麝鼠可分泌麝鼠香，香腺形态和泌香过程在一年中从三月至十月呈现周期性变化。麝鼠香的主要成分为有机酸类物质、醛类、烷类、酯类以及麝香酮、降香酮等环酮类物质。这些成分与天然麝香成分相同，所以麝鼠香可被用来代替麝香，其成分中2%的麝香酮与天然麝香有着类似的药理作用，通常被用于疾病的临床治疗，如抗炎镇痛、降低血压等。麝鼠香中大环酮类等物质分子对接研究发掘出10个关键靶点，展示出麝鼠香也可能在肿瘤的发生、发展和扩散等方面具有一定的药用功效。

● 麝鼠（白素英 摄影）

B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bcl-XL/Bcl-2 associated death promoter，Bad)是Bcl-2(B-cell lymphoma-2，B淋巴细胞瘤-2）家族中促进凋亡的主要基因之一。Bad基因编码的产物与凋亡抑制基因表达产物结合，形成异源二聚体，与Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-2样蛋白2 (Bcl-W)竞争性结合，影响这些蛋白与细胞凋亡调节因子(Bcl-2 associated X，Bax)的异二聚化水平，以此来达到促进细胞凋亡的目的，从而发挥其促进机体细胞凋亡的生理作用。该蛋白在进化上高度保守，广泛存在于动物的组织和器官中，可通过细胞信号转导通路以及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族成员作用而促进细胞凋亡。基于前期研究香腺miRNA测序，筛选出显著差异的miRNA，Bad基因作为靶基因之一且为Bcl-2家族中关键基因，推测该基因可能与Bcl-2家族相关基因一样参与调控香腺发育与泌香过程。因此，本研究基于生物信息学的方法分析麝鼠的Bad基因及其蛋白质氨基酸序列的结构特征等，为该基因在麝鼠香腺周期性发育过程中的作用提供一定的基础数据。

生物信息学分析显示：麝鼠Bad蛋白的相对分子质量为2 2087.40，半衰期为30 h，等电点为9.63，是不稳定的碱性亲水性蛋白，由204个氨基酸组成。二级和三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。此外，麝鼠Bad蛋白有5个苏氨酸位点和21个丝氨酸位点以及1个N-糖基化位点，这些氨基酸为该蛋白翻译后潜在修饰位点。

●麝鼠Bad蛋白的结构和理化性质

A.   麝鼠Bad蛋白亲/疏水性预测；B.麝鼠Bad蛋白二级结构预测; C.麝鼠Bad蛋白磷酸化位点预测; D.麝鼠Bad蛋白三级结构预测; E.麝鼠Bad蛋白N-糖基化位点预测

序列比对显示Bad蛋白比较保守。进化分析结果显示，麝鼠与仓鼠科物种亲缘关系较近。

● 麝鼠与7个物种Bad蛋白氨基酸序列相似性

● 麝鼠Bad蛋白系统发育进化树

与Bad相互作用的蛋白有Bcl-2、Akt1、Akt2、Ywhaq、Ywhaz、Ywhab和Mapk8等。结构域预测结果显示，氨基酸从43~204为Bcl-2-Bad结构域，含有Bcl-2的同源结构域3(BH3)。

● 麝鼠Bad蛋白互作网络与结构域预测

A. 麝鼠Bad蛋白互作网络; B.麝鼠Bad蛋白结构域预测

BH3结构域：Bad蛋白的促凋亡作用主要依赖于BH3结构域。去磷酸化时，通过BH3结构域与Bcl-2结合，释放Bax形成同二聚体，引发细胞凋亡。在有凋亡信号时，Bad在线粒体膜外发挥促凋亡作用。线粒体通路正是Bcl-2家族基因调控内在凋亡途径的主要靶点。在麝鼠香腺发育周期中，Bcl-2和Bax的表达量变化影响香腺的发育和萎缩。Bad蛋白与Akt相互作用，参与细胞增殖、存活及代谢等功能的调节。Akt在麝鼠发育周期中随着月份的递增相对表达量下降。因此，推测在麝鼠香腺萎缩过程中Bad蛋白与Bcl-2、Akt、Ywhaq、Ywhaz、Ywhab等蛋白相互作用促进香腺细胞凋亡并导致香腺逐渐萎缩。

Mapk8/JNK通路：JNK是磷酸化激酶，通过磷酸化修饰下游底物发挥功能。活化的JNK对Bad蛋白苏氨酸的201位点进行磷酸化，可能具有抗凋亡作用。

14-3-3蛋白家族：Bad蛋白的丝氨酸第112位和第136位点磷酸化后，可与14-3-3蛋白结合，提高细胞存活可能性。暗示Bad蛋白在香腺发育过程中可能具有抑制凋亡的作用。

以上研究说明，与不同蛋白互作Bad蛋白可能发挥不同的功能，产生不同的效应。本研究结果可为进一步探究麝鼠Bad基因在香腺周期性发育中的功能提供参考。

● 第一作者简介：崔元曦（1998—），女，硕士研究生；主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail:1964634422@qq.com

● *通信作者：白素英，E-mail：baisynefu@qq.com