关注森林网

https://mp.weixin.qq.com/s/6s3kGJnkVBp-24x-qSez5Q

★ 线粒体Cyt b基因对九种穿山甲鉴别力的分析

韩松霖1，马跃1,2，李波1,2,3，刘微1,2，穆佳童1，徐艳春1,2,3，杨淑慧1*

（1. 东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2. 国家林业和草原局野生动植物检测中心，哈尔滨，150040；3. 国家林业和草原局野生动物保护与利用工程技术研究中心，哈尔滨，150040）

论文摘要

为优化穿山甲的分子鉴定方法，采用9种穿山甲54条Cyt b基因完整序列，评估了MEGA11软件中的7种模型和23种碱基替换类型所估算的遗传距离的物种分辨率、Cyt b基因全序列及各区域的鉴别力。结果表明：K2P模型和p-distance模型基于颠换（Tv）计算的遗传距离具有最优的物种分辨率；Cyt b基因全序列有较好的物种鉴别能力，其中，第301 ~ 400号和第851 ~ 950号的2个碱基序位片段组合时具有最高的物种分辨率，是鉴别9种穿山甲的最佳理论区段。现有的方法中推荐使用Kocher等的引物。今后在研发中采用多重PCR结合高通量测序对多片段组合进行分析，将会大幅提高穿山甲的鉴别力。

论文速览

穿山甲主要分布于亚洲、非洲的热带及亚热带地区，2023年，Gu et al.通过对海关查获的穿山甲进行群体基因组学分析，发现了一个新的物种，命名为神秘穿山甲（Manis mysteria），使其成为第9种穿山甲或第5种亚洲穿山甲，但其分布地区目前仍不清楚。

近年来，大量穿山甲制品自非洲、东南亚通过走私流入亚洲和欧美市场，其中穿山甲甲片是海关查获最多的产品。在打击走私过程中，对查获的甲片进行物种鉴定是其关键环节。本研究以线粒体Cyt b基因序列为对象，探究适合穿山甲物种鉴定的最佳遗传距离计算方法，评估并筛选鉴别力较优的区段，为建立可靠的穿山甲物种鉴定方法提供参考。

● 两种滑窗长度的Cyt b基因序列在种内遗传距离（Intra-d）95%置信上限和种间距离（Inter-d）95%置信下限之差的动态变化

● 片段组合种内及种间遗传距离置信区间统计

MY. 神秘穿山甲；PE. 中华穿山甲；JA. 马来穿山甲；ST. 南非穿山甲；CR. 印度穿山甲；GI. 大穿山甲；TR. 树穿山甲；CU. 菲律宾穿山甲；PT. 长尾穿山甲。

● 部分序列片段的邻接树

研究结果显示，采用K2P  Tv方法计算遗传距离对9种穿山甲的Cyt b基因片段鉴别效率最高。沿Cyt b基因，大部分片段的物种分辨率都低于全长Cyt b基因的分辨率（0.05），如在100 bp的滑窗中检测到751 ~ 850号碱基间序列最为保守，其物种分辨率仅为全长序列差值的50%；但另一些100 bp的短片段也具有较高的鉴别力，如碱基序位在851 ~ 950号的片段，其物种分辨率是Cyt b全序列的1.22倍；类似的片段还有碱基序位为551 ~ 650号、301 ~ 400号时，物种分辨率分别是Cyt b全序列的1.2倍和1.14倍。因此，如果采用多片段复合扩增和扩增子高通量测序技术，把多个这样的片段同时进行分析，能够去掉很多噪声，提高鉴别力。且自401号碱基序位后无法鉴别部分物种，必须避免使用只包含该部分碱基的片段，故而物种分辨率达全长序列的1.2倍的［（301 ~ 400） （851 ~ 950）］号碱基序位的片段组合为最佳理论选择。基于遗传距离的系统发育树也直观地支持了这一结论，这为设计更有效的穿山甲鉴定方法提供了依据。已发表的几种使用短片段的穿山甲鉴定方法中Kocher et al.设计的引物得到的长度为307 bp（96 ~ 402号碱基序位）的序列范围包含两段高分辨率区域，推测鉴定效果近似或略优于Cyt b全长序列；L14724/ H15149引物得到的长度为402 bp（1 ~ 402号碱基序位）的序列包含0 ~ 100及200 ~ 300号碱基两段低鉴别力区域，推测分辨率不及上述方法；王辰等设计的一种产物为131 bp（70 ~ 200号碱基序位）长度的引物基本位于低分辨率区域，鉴别力有限。

● 基金项目：中央高校基本科研业务费项目（2572020DR10）；国家自然科学基金项目（32170517）。

● 第一作者简介：韩松霖（1999—），男，硕士研究生；主要从事动物学与保护生物学研究。E-mail：185645457@qq.com

● *通信作者：杨淑慧，E-mail：474568251@qq.com